Technika ktorá DNA vložka a vektor molekuly sú trávené s dvoch rôznych reštrikčných enzýmov vytvoriť non-doplnkové lepkavé končí na oboch koncoch každého fragmentu obmedzenie, tak umožňuje vložiť byť spútaná na vektor špecifické orientácie a bráni vektora re-circularizing.