Kurā ievietot DNS un vektora molekulu ir hidrolizējamais ar divu dažādu ierobežojumu enzīmi, izveidot-papildu lapiņas beidzas vai nu beigās katru ierobežojumu fragments, tā ļaujot ievietot ligated vektors noteiktā orientācijā un neļaujot vektora atkārtoti circularizing tehniku.